Care este diferența dintre ZFN, TALEN și CRISPR?


Răspunsul 1:

ZFN-urile, TALEN-urile și CRISPR-urile sunt metode de editare a genomului.

ZFN: Această strategie de editare genomică folosește endonucleazele ADN personalizate numite nucleazele degetelor de zinc (ZFN).

Degetele de zinc sunt factori de transcripție; fiecare modul de recunoaștere recunoaște trei-patru baze de secvență și, prin amestecarea și potrivirea acestor module, cercetătorii pot viza mai mult sau mai puțin orice secvență dorită.

După cum puteți vedea în această diagramă, cele două structuri de pe ambele părți sunt fiecare ZFN. Fiecare ZNF are un modul care poate recunoaște în jur de 3-4 nucleotide (buclele gri). Aceste module sunt grupuri de aminoacizi. Aceste module conferă specificului genei cercetătorului. FokI este o endonuclează de restricție, care efectuează acțiunea de a provoca o tăiere cu dublu catenă (sau rupere). Acest lucru declanșează un mecanism de reparație care, dacă este reparat prin greșeală fără omologare predispusă la erori (NHEJ), sfârșește provocând inserții și / sau ștergeri care provoacă o schimbare a cadrului și eliminarea efectivă a genei.

Eficiența unei metode precum este destul de scăzută, chiar dacă este o specificitate destul de ridicată. De asemenea, sinteza ZFN atașată cu FokI este destul de scumpă și a fost dificil să o sintetizați în laboratorul dvs.; așa că a trebuit să comande de la companii precum Sigma Aldrich.

TALEN-uri: nucleazele efectoare asemănătoare activatorului de transcripție (TALEN), sunt factorul / nucleazele de transcriere dimerice construite din tablouri de 33 până la 35 de module de aminoacizi, fiecare dintre acestea vizând o singură nucleotidă. Prin asamblarea acestor tablouri, cercetătorii pot viza aproape orice secvență care le place.

Așa arată:

În acest caz, fiecare componentă a modulului este specifică pentru un nucleotid. Deci, în funcție de secvența țintă, puteți construi TALEN-ul dvs. Din nou, așa cum s-a văzut mai înainte, endonucleazea FokI va provoca o pauză cu două cateni care ar activa căile de reparație și s-ar încheia prin introducerea unui schimb de cadru.

TALEN-urile au foarte puține efecte off-target din cauza fiecărui modul care vizează un nucleotid, dar a fost încă destul de redus în eficiență.

CRISPR: În sistemul CRISPR / Cas9 (acronimul se referă la: „repetare palindromică scurtă (CRISPR) / CRISPR-asociată-9”), nuclea Cas9 face o pauză dublă în ADN-ul la un situs determinat printr-un ARN de ghid scurt (~ 20 nucleotide). Ca și în cazul altor sisteme, acea pauză poate fi reparată prin NHEJ sau recombinarea dirijată de omologie, în funcție de modul în care este utilizată.

Spre deosebire de ZFN și TALEN, CRISPR / Cas nu este creat de oameni; sistemul face parte din sistemul imunitar bacterian, în cazul în care acesta ajută la protejarea împotriva fagurilor invadatoare.

În CRISPR specificitatea este furnizată de utilizarea unei molecule de ARN care este complementară genei de interes. Odată legată, această moleculă de ARN (numită și ARN-ghid) recrutează nucleasa cas-9 care face o pauză cu două fire, ceea ce duce la un schimb de cadre dacă este reparată de NHEJ.

CRISPR este de departe cel mai eficient proces (pentru a vă face o idee, am lucrat cu pește zebra și am avut zile în care embrioni 10/10 au arătat o mutație după ce am fost injectat cu CRISPR). Eficiența variază în funcție de organism și de regiunea țintă.

Pentru a pune totul într-o singură imagine:


Răspunsul 2:

Proteinele degetelor de zinc (ZNFs) au fost primele nucleaze de „editare a genomului” care au lovit scena. Degetele de zinc sunt cel mai frecvent domeniu de legare a ADN-ului găsit în eucariote.

De obicei, sunt compuse din ~ 30 module de aminoacizi care interacționează cu triplete de nucleotide. ZNF-urile au fost concepute care recunosc toate cele 64 de combinații de trinucleotide posibile și, prin înlănțuirea diferitelor părți de deget de zinc, se pot crea ZNF-uri care recunosc în mod specific orice secvență specifică de triplete ADN.

TALEN - nucleazele efectoare asemănătoare activatorului de transcripție - sunt similare cu ZNF-urile prin faptul că folosesc motive de legare la ADN pentru a direcționa aceeași nuclează nespecifică pentru a cliva genomul într-un loc specific, dar în loc să recunoască triplete ADN, fiecare domeniu recunoaște o singură nucleotidă .

Un avantaj esențial al ambelor tehnici este acela că acestea nu se limitează la mutageneză în celulele stem embrionare de șoarece. Modificările ZNF și TALEN au fost concepute în pești zebra, muște de fructe, nematozi, șobolani, animale și chiar în fluturi monarhi.

CRISPR / Cas:

Cea mai recentă dezvoltare interesantă în tehnologia de editare a genomului este sistemul CRISPR / Cas. Sistemele CRISPR (grupate, repetate în mod regulat, scurte, repetări palindromice) / sistemele Cas (asociate CRISPR) sunt mecanisme de apărare bacteriene bazate pe ARN, concepute să recunoască și să elimine ADN-ul străin de bacteriofagul invaziv și plasmidele.

Ele constau dintr-o endonuclează Cas care este îndreptată să cliveze o secvență țintă de un ARN ghid (gARN).

Citiți mai multe aici


Răspunsul 3:

Proteinele degetelor de zinc (ZNFs) au fost primele nucleaze de „editare a genomului” care au lovit scena. Degetele de zinc sunt cel mai frecvent domeniu de legare a ADN-ului găsit în eucariote.

De obicei, sunt compuse din ~ 30 module de aminoacizi care interacționează cu triplete de nucleotide. ZNF-urile au fost concepute care recunosc toate cele 64 de combinații de trinucleotide posibile și, prin înlănțuirea diferitelor părți de deget de zinc, se pot crea ZNF-uri care recunosc în mod specific orice secvență specifică de triplete ADN.

TALEN - nucleazele efectoare asemănătoare activatorului de transcripție - sunt similare cu ZNF-urile prin faptul că folosesc motive de legare la ADN pentru a direcționa aceeași nuclează nespecifică pentru a cliva genomul într-un loc specific, dar în loc să recunoască triplete ADN, fiecare domeniu recunoaște o singură nucleotidă .

Un avantaj esențial al ambelor tehnici este acela că acestea nu se limitează la mutageneză în celulele stem embrionare de șoarece. Modificările ZNF și TALEN au fost concepute în pești zebra, muște de fructe, nematozi, șobolani, animale și chiar în fluturi monarhi.

CRISPR / Cas:

Cea mai recentă dezvoltare interesantă în tehnologia de editare a genomului este sistemul CRISPR / Cas. Sistemele CRISPR (grupate, repetate în mod regulat, scurte, repetări palindromice) / sistemele Cas (asociate CRISPR) sunt mecanisme de apărare bacteriene bazate pe ARN, concepute să recunoască și să elimine ADN-ul străin de bacteriofagul invaziv și plasmidele.

Ele constau dintr-o endonuclează Cas care este îndreptată să cliveze o secvență țintă de un ARN ghid (gARN).

Citiți mai multe aici